Etter den kryoprotektive perfusjonen blir pasienten ikke bare senket ned i flytende nitrogen.
Pasienten følger et datastyrt temperaturprogram som varer i flere dager. Sensorer inne i pasienten viser om ulike anatomiske regioner kjøles ned i takt, eller om det oppstår farlige temperaturgradienter mellom dem.
Under nedkjølingen endrer det tekniske problemet karakter. I den første fasen gjelder det å begrense isdannelse. Nær og under glassovergangen blir presisjon og termisk jevnhet viktigere enn hastighet.
Hvorfor kontrollert nedkjøling er nødvendig
Kryoprotektive midler reduserer den nødvendige nedkjølingshastigheten for å unngå isdannelse. De gjør at vannholdig vev kan gå over i en svært viskøs, glassaktig tilstand i stedet for å danne iskrystaller i stort omfang.
Glassovergangstemperaturen, ofte betegnet Tg, avhenger av løsningen, konsentrasjonen og målemetoden. Det er et intervall, ikke en universell biologisk grenseverdi.
For løsninger som er relevante for kryopreservering av mennesker, ligger dette området vanligvis mellom -120°C og -135°C.
Over dette området kan for langsom nedkjøling gi iskrystaller tid til å dannes og vokse. Under det blir materialet gradvis mer sprøtt.
Hvis overflaten kjøles betydelig raskere enn kjernen, trekker de forskjellige regionene seg sammen i ulik grad. Den termomekaniske spenningen dette skaper kan føre til sprekker.
Dette gir et snevert handlingsrom: Pasienten må kjøles raskt nok ned før vitrifisering, og deretter må temperaturgradienter og nedkjølingshastighet kontrolleres mens vevet går over i glassaktig tilstand.
Se forskjellen mellom frysing og vitrifisering for en nærmere gjennomgang av faseovergangen.
Førstegenerasjons kjøleboks
Tomorrow.bios førstegenerasjonssystem, kalt V1-kjøleboksen, var et tidlig system for kontrollert nedkjøling av hele kroppen.
Pasienten plasseres i et dedikert, isolert kammer. En datamaskin styrer det kryogene miljøet i kammeret, mens termoelementer måler temperaturen flere steder.
Kontrollenheten følger en programmert kurve i stedet for å kjøle med maksimal effekt hele tiden. Data fra hver sensorkanal registreres som en del av pasientens temperaturforløp.
Dette er allerede fundamentalt forskjellig fra direkte nedsenkning. Maskinen kan senke tempoet, holde temperaturen stabil eller endre forholdene i kammeret basert på hva som faktisk skjer med pasienten.
Andregenerasjonssystem basert på Dewar-beholder
Tomorrow.bios andregenerasjonsdesign flytter den kontrollerte nedkjølingen over i en spesialbygd Dewar-beholder.
Pasienten forblir i Dewar-beholderen, mens et spesialtilpasset lokk rommer kjølesystemet, datastyringen, ventilene, sensortilkoblingene og kabelgjennomføringene for termoelementene.
Termoelementer plasseres flere steder inne i pasienten. Flere sensorer overvåker temperaturforholdene inne i Dewar-beholderen.
Systemet registrerer dermed mer enn bare den innstilte temperaturen. Det viser hvor raskt temperaturen endrer seg i de ulike målte områdene av pasienten.
Datamaskinen justerer temperaturforholdene og nedkjølingshastigheten i Dewar-beholderen for å holde målingene innenfor grensene i protokollen.
En stor kropp kan ikke ha samme temperatur overalt under nedkjøling. Det praktiske målet er å begrense temperaturforskjellene og hindre at et målepunkt blir farlig mye kaldere eller varmere enn de andre.
Dewar-beholderens form reduserer også behovet for håndtering mellom den kontrollerte nedkjølingen og den kryogene lagringen. Den samme lukkede beholderen kan gi stabile og symmetriske temperaturforhold rundt pasienten.
Settpunkttemperatur er ikke pasienttemperatur
En kontrollenhet kan kjøle miljøet raskt ned. Den kan ikke få kroppens kjerne til å nå den samme temperaturen umiddelbart.
Varme må transporteres fra dypere vev og ut mot overflaten. Geometri, kroppssammensetning, fordelingen av kryoprotektanter og sensorenes plassering påvirker den observerte forsinkelsen.
Dette er grunnen til at én sensor i kammeret ikke er tilstrekkelig. En omgivelsestemperatur på -130°C beviser ikke at alle målte deler av pasienten har nådd -130°C.
Kontrollsystemet må ta hensyn til både absolutt temperatur og differansen mellom kanalene. Det tregeste punktet, det raskeste punktet og den samlede spredningen gir hver for seg viktig informasjon.
Kalibrering, plassering og kontinuitet i termoelementene spiller også en rolle. Usannsynlige avlesninger eller sensorfeil bør flagges, ikke uten videre glattes inn i kurven.
Tomorrow.bios temperaturprogram i tre trinn
Den nåværende protokollen har tre distinkte faser. Verdiene er driftsmål for dette utstyret og denne kryoprotektive metoden, ikke universelle konstanter for ethvert vitrifiseringssystem.
1. Rask nedkjøling mot -130°C
I den første fasen kjøles pasienten fra tørrisens temperatur mot omtrent -130°C så raskt som den målte temperaturspredningen tillater.
Hastighet er viktig her fordi regioner med for lite beskyttelse fortsatt kan danne is før vevet blir glassaktig.
Datamaskinen styrer ikke bare etter hvor lang tid som har gått. Den overvåker termoelementene og justerer kjølemiljøet rundt pasienten fortløpende.
2. En kontrollert oppvarming mot -120°C
Etter at pasienten har nådd omtrent -130°C, reduseres den aktive nedkjølingen, og pasienten får varmes naturlig mot omtrent -120°C.
Dette er en annealing-fase. Nær Tg har det kryoprotekterte materialet fortsatt nok molekylær bevegelighet til at noe av den opparbeidede mekaniske spenningen kan avspennes.
Oppvarmingen gir også varmere og kaldere områder tid til å nærme seg samme temperatur før materialet kjøles videre ned i en stivere, glassaktig tilstand.
Annealing reverserer ikke biologisk skade som allerede har oppstått. Formålet er mer avgrenset: å redusere temperaturgradienter og spenningene som ulik sammentrekning skaper.
3. Nedkjøling til -196°C med omtrent 1°C per time
Fra omtrent -120°C er målet en nedkjøling på omtrent 1°C per time til pasienten når temperaturen til flytende nitrogen.
Det siste intervallet på 76 grader tar omtrent tre dager, selv før man legger til pauser og kontrolljusteringer.
Å holde 1°C per time i en stor, termisk uensartet kropp er et kontrollproblem, ikke bare en innstilling på en tidtaker.
Kontrollenheten må fortløpende justere miljøet i Dewar-beholderen, slik at de interne termoelementene synker sammen uten at det oppstår for store gradienter.
Når én region ligger etter, kan det å gjøre miljøet kaldere overkjøle en annen region. Presisjon betyr å balansere hele sensorfeltet, ikke å jage én enkelt avlesning.
Hvorfor annealing-fasen er vitenskapelig plausibel
Forskning på vitrifisering i stor skala peker på to konkurrerende feilkilder: for lav nedkjølingshastighet over Tg og for stor mekanisk spenning ved og under Tg.
En vitrifiseringsstudie fra 2024 på skalaen til menneskelige organer brukte flere interne temperaturprober og konkluderte med at annealing reduserer gradienter før materialet går over i glassaktig tilstand.
Den samme studien fant at langsom nedkjøling under området for annealing bidrar til å hindre at store gradienter og spenninger bygges opp på nytt.
En separat termomekanisk forskning fant at annealing nær Tg endrer restspenningen betydelig og gjør den mindre avhengig av den tidligere nedkjølingshastigheten.
Disse studiene støtter den underliggende kontrollstrategien. De bekrefter ikke uavhengig hvert enkelt settpunkt i Tomorrow.bios protokoll for hele kroppen.
Hele menneskekropper er større og mer uensartede enn løsninger eller organer i laboratorieskala. Direkte temperaturmålinger og bildeundersøkelser etter nedkjølingen er fortsatt nødvendig.
Hva datamaskinen registrerer
Det nyttige resultatet er ikke en melding som sier «nedkjøling fullført». Det er den fullstendige tidsserien fra hver enkelt temperaturkanal.
Registreringen bør vise hastigheter, pauser, oppvarmingsfaser, gradienter mellom sensorene, handlinger fra kontrollenheten, alarmer og eventuelle avvik fra den planlagte kurven.
Disse dataene blir en del av kvalitetsvurderingen av kryopreserveringen.
Etter nedkjølingen kan en standardisert CT-undersøkelse ved temperaturen til flytende nitrogen vise hvordan kryoprotektanter og is er fordelt, samt grove deformasjoner og brudd som temperaturdata alene ikke viser.
Hvorfor prosessen avsluttes ved temperaturen til flytende nitrogen
Ved normalt atmosfærisk trykk koker nitrogen ved omtrent 77,34 kelvin, cirka -195,8°C, ifølge NIST Chemistry WebBook.
Lagring i flytende nitrogen er passiv. Så lenge det er nok væske i karet, opprettholder likevekten ved kokepunktet et stabilt kryogent miljø uten mekanisk kjøling.
Den kontrollerte nedkjølingen avsluttes først når pasientens temperatur er klar for denne stabile lagringstilstanden. Lagringen brukes ikke som erstatning for nedkjølingen.
Utformingen av neste trinn og avveiingene som ligger bak det, er beskrevet i artiklene om moderne kryogene Dewar-beholdere og mellomtemperaturlagring.
Kort fortalt: Tomorrow.bio bruker datastyrt nedkjøling og interne temperatursensorer. Pasienten kjøles raskt ned fram mot glassovergangen, termisk spenning avlastes, og temperaturen senkes deretter langsomt mot -196°C.
Utforsk dette praktiske verktøyet
Bruk det interaktive verktøyet for å undersøke spørsmålet i denne artikkelen.
Laster det interaktive verktøyet...
Videre lesning