Etter kryoprotektiv perfusjon er ikke en pasient bare plassert i flytende nitrogen.
Pasienten følger et datamaskinkontrollert temperaturprogram som varer i flere dager. Sensorer inne i pasienten viser om ulike anatomiske regioner kjøler seg ned sammen eller skiller seg ut i farlige termiske gradienter.
Det ingeniørmessige problemet endrer seg under nedkjølingen. Tidlig kjøling bør begrense isdannelse. Nær og under glassovergangstemperaturen blir presisjon og termisk uniformitet viktigere enn hastighet.
Hvorfor kontrollert kjøling er nødvendig
Kryoprotektive midler reduserer kjølehastigheten som trengs for å unngå is. De lar vannrike vev gå inn i en svært tyktflytende, glasslignende tilstand i stedet for å krystallisere omfattende.
Den relevante glassovergangstemperaturen, skrevet Tg, avhenger av løsningen, konsentrasjonen og målemetoden. Det er et område, ikke en universell biologisk terskel.
For løsninger relevante for menneskelig kryopreservering ligger dette området vanligvis nær -120°C til -135°C.
Over dette området kan for langsom kjøling tillate isdannelse og vekst. Under det oppfører materialet seg stadig mer som et sprøtt fast stoff.
Hvis overflaten kjøler seg mye raskere enn sentrum, trekker ulike regioner seg sammen med ulike mengder. Det resulterende termomekaniske stresset kan føre til sprekker.
Dette skaper en begrenset vei: kjøl raskt nok før vitrifisering, deretter kontroller gradienter og kjølehastighet etter hvert som pasienten blir glasslignende.
Seforskjellen mellom frysing og vitrifisering for den underliggende faseatferden.
Den første generasjons kjøleboks
Tomorrow.bio sin første generasjons system, kalt V1 kjøleboks, etablerte den grunnleggende arkitekturen for kontrollert helkroppskjøling.
Pasienten plasseres inne i et dedikert isolert kammer. En datamaskin kontrollerer kammerets kryogene miljø mens termoelementer måler temperaturer på flere steder.
Kontrolleren følger en programmert kurve heller enn å anvende maksimal kjøling kontinuerlig. Hver sensor kanal registreres som en del av pasientens termiske historie.
Dette er allerede fundamentalt forskjellig fra direkte nedsenking. Maskinen kan bremse, holde eller endre kammerets forhold som respons på hva pasienten faktisk gjør.
Det andre generasjons dewar-baserte systemet
Tomorrow.bio sin andre generasjons design flytter den kontrollerte nedkjølingen inn i en spesialbygd dewar.
Pasienten forblir inne i dewaren mens et spesialtilpasset lokk integrerer nedkjølingsmaskineriet, datamaskinstyring, ventiler, sensorforbindelser og termoelementgjennomføringer.
Termoelementer er plassert på flere steder inne i pasienten. Ytterligere sensorer overvåker det termiske miljøet inne i dewaren.
Systemet ser derfor mer enn den ønskede settpunktstemperaturen. Det ser hvor raskt ulike målte områder av pasienten reagerer.
Datamaskinen justerer dewarens temperaturgradient og nedkjølingshastighet for å holde disse avlesningene innenfor protokollens tillatte ramme.
En stor kropp kan ikke være perfekt isoterm under nedkjøling. Det praktiske målet er å minimere spredningen og forhindre at noe målt område kommer farlig foran eller bak.
Dewarens geometri reduserer også håndteringen mellom kontrollert nedkjøling og kryogen lagring. Den samme innelukkede formen kan gi et stabilt, symmetrisk miljø rundt pasienten.
Settpunktstemperatur er ikke pasientens temperatur
En regulator kan gjøre miljøet kaldt raskt. Den kan ikke få midten av en menneskekropp til å matche den temperaturen umiddelbart.
Varme må bevege seg fra dypere vev mot overflaten. Geometri, kroppssammensetning, fordeling av kryobeskyttelsesmiddel og sensorplassering påvirker den observerte forsinkelsen.
Derfor er én kamersensor utilstrekkelig. Et nominelt -130°C miljø beviser ikke at hver målte del av pasienten har nådd -130°C.
Styringssystemet må ta hensyn til både absolutt temperatur og forskjellen mellom kanalene. Det tregeste punktet, det raskeste punktet og den totale spredningen gir hver sin informasjon.
Kalibreringsnøyaktighet, plassering og kontinuitet for termoelementene har også betydning. Urimelige avlesninger eller sensorfeil bør varsles i stedet for å bli stille gjennomsnittet inn i kurven.
Tomorrow.bio sin tretrinns temperaturprogram
Den nåværende protokollen har tre distinkte faser. Verdiene er operasjonsmål for dette utstyret og det kryobeskyttende tilnærmingen, ikke universelle konstanter for ethvert vitrifiseringssystem.
1. Raskt ned mot -130°C
Den første fasen flytter pasienten fra tørris-temperatur mot omtrent -130°C så raskt som den målte temperaturspredningen tillater på en trygg måte.
Hastighet er viktig her fordi ubeskyttede områder fortsatt kan danne is før vevet blir glassaktig.
Datamaskinen følger ikke bare med på tid. Den overvåker termoelementene og justerer kjølemiljøet rundt pasienten.
2. Tillat en kontrollert tilbakegang mot -120°C
Etter at du har nådd omtrent -130°C, reduseres aktiv avkjøling og pasienten får varmes naturlig opp til omtrent -120°C.
Dette er en glødefase. Nær Tg beholder det kryobeskyttede materialet nok molekylær mobilitet til at noe akkumulert mekanisk stress kan slappe av.
Tilbakestigningen gir også varmere og kaldere områder tid til å komme nærmere hverandre før materialet føres dypere inn i sin stive glassaktige tilstand.
Gløding reverserer ikke eksisterende biologisk skade. Hensikten er smalere: redusere termiske gradienter og spenningene som oppstår på grunn av ulik sammentrekning.
3. Gå ned til -196°C med omtrent 1°C per time
Fra omtrent -120°C er målet for nedstigningen omtrent 1°C per time inntil pasienten når flytende nitrogen-temperatur.
Det endelige 76-graders intervallet tar omtrent tre dager, selv før hold og kontrolljusteringer telles med.
Å opprettholde 1°C per time i en stor, termisk heterogen kropp er et kontrollproblem, ikke bare en tidsinnstilling.
Kontrolleren må kontinuerlig justere dewar-miljøet slik at de interne termoelementene synker sammen uten å skape for store gradienter.
Når ett område henger etter, kan det å tvinge miljøet kaldere overkjøle et annet område. Presisjon betyr å balansere hele sensorfeltet, ikke å jage én enkelt avlesning.
Hvorfor glødefasen er vitenskapelig plausibel
Storskala vitrifiseringsforskning identifiserer to konkurrerende feilsoner: utilstrekkelig avkjøling over Tg og overdreven mekanisk stress rundt og under Tg.
En2024 human-organ-skala vitrifiseringsstudie brukte flere interne sonder og konkluderte med at gløding reduserer gradienter før materialet går inn i glassfasen.
Den samme studien fant at langsom avkjøling under glødeområdet bidrar til å unngå å bygge opp store gradienter og stress.
Separattermomekanisk forskning fant at gløding nær Tg endrer vesentlig gjenværende stress og svekker dets avhengighet av den foregående avkjølingshastigheten.
Disse studiene støtter den underliggende kontrollstrategien. De validerer ikke uavhengig hver eksakte innstilling i Tomorrow.bio sitt helkroppsprotokoll.
Hele menneskekropper er større og mer heterogene enn laboratorieløsninger eller organer. Direkte temperaturregistreringer og avbildning etter nedkjøling forblir nødvendige.
Det som datamaskinen registrerer
Den nyttige utdataen er ikke en melding som sier «nedkjøling fullført». Det er hele tidsserien fra hver temperatursensor.
Registreringen bør vise hastigheter, hold, tilbakeslag, gradienter mellom sensorer, kontrollertiltak, alarmer og eventuelle avvik fra den planlagte kurven.
Disse dataene blir en del avkvalitetsvurderingen av kryopreservering.
Etter nedkjøling kan standardisert CT ved flytende nitrogen-temperatur vise fordeling av kryoprotektant, is, grove deformasjoner og brudd som temperaturdata alene ikke kan avsløre.
Hvorfor avslutte ved flytende nitrogen-temperatur
Ved normalt atmosfærisk trykk koker nitrogen nær 77.34 kelvin, omtrent -195.8°C, ifølgeNIST Chemistry WebBook.
Lagring i flytende nitrogen er passiv. Så lenge det er tilstrekkelig flytende nitrogen i beholderen, opprettholder kokepunktets likevekt en stabil kryogen tilstand uten mekanisk kjøling.
Den kontrollerte nedstigningen avsluttes først når pasienten er termisk klar for denne stabile tilstanden. Lagring brukes ikke som erstatning for nedkjøling.
Utformingen og avveiningene for neste fase dekkes imoderne kryogene dewarer og mellomtemperaturlagring.
TL;DR: Tomorrow.bio bruker datastyrt nedkjøling og interne temperatursensorer. Prosessen kjøler raskt nær glassdannelsen, reduserer termisk stress, og går deretter sakte ned mot -196°C.
Utforsk dette praktiske verktøyet
Bruk det interaktive verktøyet for å undersøke spørsmålet i denne artikkelen.
Laster det interaktive verktøyet...
Videre lesning